金斯瑞，助力首例Car-T临床试验中美双报成功，现向广大中国客户提供Car-T临床申报用质粒开发生产服务。我们组建了一支具有GMP生产经验的专业团队；建设了1000平米符合GMP规范的生产车间并配备50L-100L的一次性生物反应器及不锈钢发酵罐；提供一站式质粒开发服务，从稳定菌种库构建、工艺开发、方法学开发验证，稳定性研究等一直到临床试验申报。
金斯瑞Car-T用质粒平台
Development Process
-
菌种库构建
- Cell pool screening
- Cell clone screening
- Cell banking -
工艺开发
- Culture optimization
- Purification optimization
- Small scale production -
方法学
- Development
- Validation
- Batch release -
规模生产
Manufacture Process
稳定菌种库的构建
金斯瑞拥有全面的稳定菌种库开发能力，从客户提供的DNA序列开始，经过质粒构建、分子克隆和转染、细胞池筛选，直到筛选出稳定、高表达的单克隆菌株。在确定稳定菌株后，我们将在GMP条件下建立RCB（初级菌种库）, MCB （主菌种库）和WCB（工作菌种库）。
工艺开发
上游培养工艺： 主要是针对Animal-free 培养基、补料选择、添加方式及罐上发酵工艺的开发和优化。通过DOE设计，对pH、通气及溶氧进行范围控制，优化培养时间、温度等获得较高的表达水平及发酵稳定性。
下游纯化工艺： 主要是针对上样条件，包括上样体积及层析流速、洗脱程序的优化， 通过DOE设计优化层析柱及层析条件，为客户提供一个稳定的、可重复的、可放大的、经济的纯化工艺流程。
10L工艺小试生产： 根据工艺开发建立的流程，金斯瑞开展放大至10L小试生产。
方法学开发验证
符合《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）规定的分析方法的验证及确认，并建立质粒生产质量放行标准。可以根据项目的特殊要求进行定制生产，以满足不同的需求。
参考标准
| Cell Back QC | Specification |
|---|---|
| Plasmid identity | Restriction enzyme mapping Sequencing (double strand) |
| Plasmid yield | Spectrophotometric determination |
| Plasmid genetic stability | Segregating analysis |
| Host Cell Identity | 16s rDNA Sequencing Colony morphology Gram staining API 20E |
| Antibiotic resistance | Multiple plates with various antibiotics |
| Cell Bank Viability | CFU/mL plate count analysis |
| Host Cell Purity | Visual observation method |
| Lytic Phage Contamination | Plate bacterial cells on media |
| Plasmid QC | Specification | |
|---|---|---|
| DNA concentration | UV | 1mg/ml |
| Appearance | Visual inspection | Clear |
| A260/A280 | Absorbance ratio | 1.8-2.0 |
| Restriction Digest | AGE | Consistent |
| Plasmid Form (% supercoiled) | HPLC | >90% |
| Host Protein | ELISA | < 1% |
| Host Cell Purity | HPLC | >90% |
| Residual E. coli DNA | qPCR for host gDNA | <0.1% |
| Residual E. coli RNA | HPLC for host RNA | <0.1% |
| Endotoxin | PTS | <10EU/mg |
| Mycoplasma | PCR | Not Detected |
| Sequencing GMP, incl. documentation | Consistent | |
| pH | pH meter | 7.0-8.5 |
| Sterility | USP <71> Sterility Test | Not Detected |
批次生产及放行
经过与客户确认后，根据工艺开发建立的流程，参照质量放行标准，金斯瑞开展放大至50L中 试生产，具体流程如下：
- 3批50L GMP级别中试生产，在搅拌式不锈钢生物反应器中进行并进行纯化。
- 对纯化后质粒进行各项放行检测。
工艺转移，资料撰写与临床申报
专家组及项目管理团队通过提交材料文件，会议及现场沟通等方式完成工艺，质量研究及技术的转移，并提供临床申报指导及材料的撰写，确保临床试验申报成功。
金斯瑞服务
| Service | Catalog No | Milestone Service | Application |
|---|---|---|---|
| 临床申报质粒开发 GMP INDSet? Plasmid Development |
SC2000 |
|
临床试验申请 |
| GMP质粒生产 GMP-Compliant? Plasmid Preparation |
SC2001 |
|
临床试验I期 （早期临床试验） |